Эдди считал, что будущее за клонированием ДНК в бактериях, то есть примерно за тем, с чего я сам начинал работу с мумиями еще в 1980-х в Упсале. Эти методы, убеждал он меня, стали теперь намного более эффективными, чем в те давние времена. Я согласился проверить эффективность новых методик и отправил ему в лабораторию в Беркли экстракты двух костей пещерных медведей, содержавшие, как мы уже знали, большое количество мтДНК. В его лаборатории к молекулам ДНК из этих вытяжек присоединили молекулы-транспортеры и с их помощью внедрили ДНК в бактерий. По ходу роста и деления каждой бактерии получается клон, содержащий тысячи копий уникальной ДНК из костной вытяжки. Остается взять и прочитать ДНК каждого из получившихся клонов, словно книги из обширной библиотеки. Команда Эдди использовала традиционную химию Сэнгера для секвенирования 14 тысяч случайным образом выбранных клонов из двух библиотек — о таких цифрах в 1984-м можно было только мечтать. Из 14 тысяч клонов только 389, то есть 2,7 процента, содержали цепочки ДНК, похожие на те, что имеются у собак, и, таким образом, с большой вероятностью принадлежавшие пещерным медведям.
Остальное пришло от бактерий и плесени, поселившихся на костях после смерти животного. И хотя пропорция собственной медвежьей ДНК была до смешного мала, но все же результат вдохновлял: значит, ядерная ДНК все-таки есть в костях из пещер Европы!
Результаты мы опубликовали в 2005 году в Science, Эдди и его группа значились основными авторами[46]. Статья несколько претенциозно утверждала, что прочитать древний геном — да, возможно. Но уже после публикации некоторые члены моей лаборатории, рассмотрев результаты более взвешенно и произведя дополнительные расчеты, пришли к неутешительным выводам. Группа из Беркли секвенировала каждый фрагмент ДНК из библиотек, которые мы им переслали, и выявила в сумме 26 861 нуклеотид из генома пещерного медведя. Если принять во внимание, что мы использовали десятую часть грамма костной ткани для составления библиотек и что геном состоит примерно из трех миллиардов нуклеотидов, нам придется увеличить количество исследуемой ткани в сотню тысяч раз — то есть понадобится больше десяти килограммов костей. Только так нам удастся хотя бы приблизительно составить геном пещерного медведя. Предположим, мы справились с немыслимо трудоемкой задачей перемолоть такое количество костей и получить из порошка вытяжки, но секвенирование в таких масштабах обойдется в баснословную сумму. И даже если с пещерным медведем как-то можно получить результат, то в случае действительно интересных ископаемых, от которых для исследования остаются в прямом смысле крохи, количественный, “массированный” подход просто бесполезен. Я лично считал, что секвенирование неандертальского генома с помощью клонирования в бактериях — это тупик. Просто невозможно, и все. По моим представлениям, большая часть ДНК должна была потеряться при получении бактериальных библиотек: ведь ДНК может просто не попасть в бактерию или, все же попав, деградировать под действием бактериальных ферментов. Эдди, однако, энтузиазма не терял и утверждал, что мы получили нехарактерно низкий процент продукта секвенирования. Он даже говорил, что следующие попытки потребуют меньше материала и наверняка окажутся более успешными.
Несмотря на все воодушевление Эдди, я был уверен, что необходимо попробовать и пиросеквенирование: неправильно полагаться только на один метод. Вариант с пиросеквенированием, казалось, прямо создан для нашего материала: мы могли избежать потерь, неизбежных, когда имеешь дело с капризной бактерией. К тому же Джонатан Ротберг вместе с 454 запустил установку, способную секвенировать сотни тысяч молекул ДНК за день. До самого Джонатана просто так было не добраться: он очень мудро забаррикадировался от одержимых ученых, которым во что бы то ни стало нужна была новая технология и которые по самую макушку завалили бы его запросами и требованиями. Я попытался до него дотянуться, но ничего не вышло. В какой-то момент я посетовал на это Джину Майерсу — тому самому гению биоинформатики, который помог знаменитому Крейгу Вентеру сложить геном человека в 2000 году. Я познакомился с Джином на съезде биоинформатиков в Бразилии в 2001 году, и его шутливое отношение к любой проблеме немедленно завоевало мою симпатию. Нас окончательно сблизил общий интерес к горным лыжам и дайвингу. К моменту нашего рассказа Джин занимал должность профессора в Беркли и выступал советником в организации Ротберга, так что в июле 2005-го он составил мне протекцию и помог связаться с Джонатаном.
И вот я говорю с Джонатаном и с Майклом Эгхольмом, датским ученым, менеджером 454, по трехсторонней электронной связи, — и волнуюсь. Да, Джонатан энергичен и напорист, как и следовало ожидать от предпринимателя такого масштаба, но его явно интересует только одно — прочитать геном динозавра! Как же мне быть и как себя вести? Ведь я всегда во всеуслышание заявлял, что секвенировать ДНК динозавра невозможно ни сейчас, ни в будущем. Я попытался как-то помягче, чтобы Джонатан не занес меня сразу в черный список, еще раз пройтись на эту тему и одновременно намекнуть на существование других презанятных геномов, особенно — продолжал намекать я — неандертальского. К счастью, Джонатана сразу же заинтриговала идея выяснить с помощью его аппарата, что делает человека человеком. Мне даже удалось убедить их с Эгхольмом, что начинать нужно с пещерных медведей и мамонтов.
И уже через неделю почта доставила экстракты мамонтовой и медвежьей кости в 454 Life Sciences. В это же время к нам в лабораторию поступил на работу трудолюбивый и талантливый молодой специалист — биоинформатик Ричард Эд Грин. Он только что защитил диссертацию в Калифорнийском университете в Беркли. Эд выиграл очень престижную и к тому же щедро финансируемую стипендию от Национального научного фонда США: он должен был выполнить проект по сравнению РНК-сплайсинга у человека и обезьян. Сплайсинг — это процесс, при котором из копий РНК, считанных с ДНК, вырезаются ненужные кусочки, разрезанные концы соединяются и превращаются в зрелую матричную (или, по-другому, информационную) РНК, и она уже непосредственно используется в белковом синтезе. По предположениям Эда, разница в схемах соединения разрезанных концов РНК могла объяснить многие человеческие и обезьяньи особенности.
Он как раз этим занимался, когда пришли первые результаты из 454.
Команда из 454 составила сотни тысяч последовательностей ДНК из костей мамонта и пещерного медведя.
