Метод секвенирования Сэнгера основан на прикреплении нуклеотидов поочередно друг за другом ДНК-полимеразой, ферментом, который выстраивает новую цепочку ДНК на матрице имеющейся цепочки. В реакции секвенирования ДНК-полимераза берет старт от праймера в назначенном месте ДНК. Далее небольшие порции каждого из четырех нуклеотидов метят разными флуоресцентными красителями и, кроме того, немного изменяют их химически. В результате после встраивания такого измененного нуклеотида реакция секвенирования останавливается именно в месте его прикрепления. Получаются цепочки ДНК разной длины, и концы таких фрагментов раскрашены разными цветами. По этим цветам можно понять, что за нуклеотид сидит на конце. Эти фрагменты — а они разной длины — подвергают процедуре электрофореза. При электрофорезе кусочки ДНК распределяются в геле соответственно своим размерам (длинам, молекулярным весам). И тогда можно посмотреть, как цветные метки и, следовательно, нуклеотиды в этом геле расположены: например, метка и нуклеотид в 10-й позиции от места старта, в 11-й позиции, в 12-й и т. д. На самом лучшем оборудовании для считывания, какое использовалось, к примеру, в проекте “Геном человека”, можно анализировать сразу сотни фрагментов ДНК длиной до 800 нуклеотидов. И что же проделал Поль Нюрен в лаборатории Матиаса? А вот что: он изобрел новый метод секвенирования, так называемый метод пиросеквенирования. И хотя пиросеквенированию предстояло еще хорошенько повзрослеть, но в перспективе оно обещало стать и быстрее, и проще метода Сэнгера.
При пиросеквенировании тоже используется ДНК-полимераза; она так же выстраивает комплементарные цепочки ДНК на матрице, но определение череды новоприкрепленных нуклеотидов устроено по-другому, в обход трудоемкого процесса разделения фрагментов по размеру. В этом случае нуклеотиды определяются по световым вспышкам, которые испускаются в момент присоединения нуклеотида к цепочке ДНК. Поль придумал, что можно добавлять в реакционную камеру по одному из четырех типов нуклеотидов по очереди. И тогда при добавлении, например, А (аденина) к исходной цепочке с концевым Т (тимином) ДНК-полимераза пристроит аденин к тимину, и в этот момент в результате химических реакций произойдет световая вспышка. Эту вспышку можно зафиксировать мощной камерой и передать на компьютер. А если в концевой позиции стоит не тимин, а любой другой нуклеотид — что же, тогда реакции не произойдет и светового импульса не будет. Поль добавлял в реакционную камеру по очереди нуклеотид за нуклеотидом, повторяя цикл за циклом. По вспышкам света он мог прочитать всю нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК. Прекрасный метод: требуется только своевременно добавлять нуклеотиды и другие компоненты в реакционную камеру и следить за отснятыми картинками. Но что еще лучше — этот процесс можно легко автоматизировать.
И когда Матиас обо всем этом рассказывал, я воодушевился не меньше, чем он. Спустя некоторое время Матиас пригласил меня поучаствовать в экспертном совете компании “Пиросеквенирование”, которую они с Полем учредили для разработки коммерческого продукта на основе новой технологии. Я с удовольствием согласился: это давало мне возможность быть в курсе развития замечательной технологии, которая, как я считал, могла здорово изменить наши методы изучения палео-ДНК. Я стал членом экспертного совета в 2000 году, спустя год после запуска в производство первого коммерческого аппарата. Он секвенировал одновременно девяносто шесть фрагментов ДНК, каждый в отдельной лунке пластикового планшета. Однако этот аппарат мог прочитать подряд только тридцать последовательных нуклеотидов или около того. По сравнению с современными машинами, работающими на принципе Сэнгера, “тридцать нуклеотидов” звучало довольно жалко, но ведь пиросеквенирование делало первые шаги и еще не достигло предела своих возможностей. На самом деле, хотя тогда я и не понимал этого, Нюрен положил начало революции в секвенировании, известной теперь как секвенирование второго поколения, которая в конце концов фундаментально изменила не только подход к изучению ископаемой ДНК, но и множество направлений в биологии.
Я очень хотел опробовать пиросеквенирование и поэтому уговорил Хенрика Кессманна отправиться в стокгольмскую лабораторию Матиаса в Королевский технологический институт. Хенрик ухватился за возможность полюбоваться на вытянутые от удивления лица стокгольмцев, когда он поприветствует их на безупречном шведском; хоть он и вырос в Германии, мать его была шведкой, и он прекрасно говорил на ее языке. Кроме того, он лихо управлялся с данными о современном народонаселении Европы и Азии и на их основе мог реконструировать возможные генетические связи между популяциями. Что же до новых технологий — он их отлично освоил, хотя не обошлось без трудностей.
В августе 2003 года совет компании “Пиросеквенирование” подписал разрешение на использование нового инструмента американской компанией 454 Life Sciences, основанной предпринимателем-биотехнологом Джонатаном Ротбергом. 454 Life Sciences намеревалась улучшить методы пиросеквенирования с помощью ультрасовременной струйной автоматики. Их нововведения базировались на присоединении коротких синтетических ДНК к концам фрагментов изучаемой ДНК. С помощью этих коротких кусочков одноцепочечные нити ДНК прицеплялись к микрошарикам, и затем в жировых капельках на шариках проходила массированная амплификация присоединенных фрагментов. В результате этого гениального хода в капельках жировой эмульсии синтезировались одновременно, но по отдельности, каждая в своей капельке, сотни тысяч нитей ДНК. Затем шарики разделялись на планшетке теперь уже с тысячами лунок, и далее начинался собственно пирофосфатный этап. И наконец (и это такое серьезное “наконец”!), составлялись таблицы вспышек для каждой лунки в каждом цикле. Для этого компания позаимствовала методику регистрации световых импульсов у астрономов — ведь астрономам приходится наблюдать миллионы ночных звезд и как-то регистрировать свои наблюдения. И все это вместе позволило секвенировать за раз не девятосто шесть, а двести тысяч фрагментов ДНК!
С такими мощностями, подумал я, мы могли бы просто секвенировать все подряд фрагменты палео-ДНК из вытяжек, все, что попадется, а потом проверять, что в них содержится. Метод “массированной атаки”, по сути, прямо противоположен тем техникам, когда приходится вылавливать каждый тщательно выбранный заранее кусочек ДНК. По сравнению с пиросеквенированием метод, основанный на выискивании отдельных сегментов с помощью ПЦР, не только ужасно трудоемок, но и решительно ограничивает поле зрения только одним, заранее заданным фрагментом, лишает возможности посмотреть, какие же еще ДНК содержатся в вытяжке. И хотя с помощью тогдашнего инструментария 454 Life Science нельзя было прочитать фрагмент длиннее ста нуклеотидов, но ведь цепочки, секвенированные Алексом из мамонта и Хендриком из гигантского ленивца, все равно получались не больше ста нуклеотидов. Мне не терпелось опробовать технику 454.
О новых методиках я советовался не только с Матиасом и остальными “пиросеквенистами”. В июле
