С 1376 года Гродно стало владением молодого князя Витовта Кейстутьевича. В 1385 году для совместной борьбы с крестоносцами в замке Крево, близ Сморгони, Польской короной и Великим княжеством Литовским была заключена уния, по которой Великий князь Литовский Ягайло, двоюродный брат Витовта, возглавил оба государства, став и польским королем. Ущемление литовских интересов вызвало противодействие князя трокского и гродненского – Витовта. В результате двухлетних военных действий Витовт стал Великим князем Литовским, потеряв двух малолетних сыновей, отравленных крестоносцами. Больше сыновей у него не было.

Исследователь XIX века писал об этой «войне без правил»: «Витовт всеми мерами старался дела Литвы не смешивать с делами Польши. Такое стремление Витовта, видевшего в Ягайло опасного врага своего Отечества, и незабытая месть за убийство своего отца, мужественного Кейстута, с одной стороны, а с другой – ненасытное честолюбие польского короля, произвели междоусобную войну, в которой Гродне суждено было испытать удары попеременно – сперва от Ягайло, потом от Витовта.

Витовт, не надеясь на свои силы, искал помощи у Тевтонского ордена. Отправляясь для этого в Пруссию, он оставил в Гродне сильный литовско-русско-немецкий гарнизон, под начальством рыцаря Маркверда Зальцбаха. Ягайло подступил к городу с сильным войском, в марте 1390 года, и тотчас осадил крепость. Витовт, пришедший с рыцарями на помощь, не мог помочь осажденным, потому что весенний разлив Немана воспрепятствовал переправе. Между тем в крепости немцы не поладили с литовцо-русами, и Гродно сдался польскому королю Ягайло.

Неутомимый Витовт в следующем 1391 году, в союзе со знаменитым гроссмейстером Кондратом Валленродом, снова осадил гродненскую крепость и взял ее, несмотря на упорную оборону, причем значительная часть поляков была отведена в плен в резиденцию гроссмейстера Мальборк, а многие даже казнены. В благодарность за оказанную помощь Витовт позволил рыцарям поселиться на левой стороне Немана, выстроить там новый замок и занять его немецким гарнизоном; вновь выстроенный замок рыцари назвали Новое Гродно. Но в том же году, помирившись с Ягайло, Витовт был вынужден, по политическим видам и по недоверчивости к влаголюбивым замыслам ордена, удалить гарнизон, разрушить замок Новое Гродно, а в старом – поставить гарнизон литовско-русский. Оскорбленный изменчивостью политики Великого князя, гроссмейстер направил к Гродно сильное войско под предводительством маршала Тетингена и командора Гельфенштейна, которым сопутствовали многие французские и немецкие рыцари.

На третий день осады Гродно пал, причем погибло до 1000 человек гарнизона, а 3000 отведено в плен, Верхний и Нижний замок разрушены, город сожжен и окрестности опустошены. По примирении с орденом, Витовт отстроил город, возобновив укрепления».

В 1398 году замок полностью сгорел, сам Витовт спасся чудом. Было решено строить каменный замок, и он был возведен очень быстро – в 1402 году его безуспешно штурмовали крестоносцы.

Замок в виде треугольника возвели по краю горы, со стенами длиной 120, 90 и 70 метров, с толщиной стен до 3 метров. Замок имел 5 башен с основаниями 12 на 12 метров. От башни-брамы шла дорога ко дворцу Витовта, двухэтажному, размером 45 на 15 метров. Сухой 50-метровый ров отделял Верхний замок от Нижнего, также восстановленного в камне, и от города-посада.

Получившее в 1391 году Магдебургское право Гродно стало второй, после Вильно, столицей Великого княжества Литовского. Именно из Гродно Витовт повел свои хоругви в 1410 году на Грюнвальдские холмы.

В 1413 году из Гродненского и Трокского княжеств было образовано Трокское воеводство и Гродно стал поветовым центром. Сам Витовт, его наследники на великим княжении и многие польские короли часто бывали в Гродно, решая в нем важные государственные дела.

17 октября 1432 года в Гродно сын скончавшегося Витовта Сигизмунд, вопреки советам элиты Литвы, подписал акт присяги на верность польскому королю.

В 1445 году в Гродно Великий князь Литовский Казимир стал и польским королем и провел в городе большую половину своего долгого царствования, что пошло на пользу развитию и украшению Гродно.

В 1442 году новый Великий князь Литовский Александр дал Гродно полное Магдебургское право. В городе было разрешено трижды в год проводить недельные ярмарки.

С 1576 по 1586 год Гродно стал главной и любимой резиденцией короля Речи Посполитой Стефана Батория. Итальянский архитектор С. Гуччи восстановил в стиле ренессанса гродненский замок, впоследствии названный Старым. Замок лишился старых построек, включая дворец Витовта. В верхнем замке итальянец Скотто построил для Стефана Батория двухэтажный дворец, также в стиле ренессанса, размером 20 на 60 метров. Первый этаж занимала охрана, там же располагалась казна, канцелярия, архив, кладовые. На втором находились богатые королевские покои, с каменной резьбой, мраморными полями, изразцами. Дворец имел ходы на стены и башни Верхнего замка. Был перестроен и Нижний замок. Тогда же для защиты населения от нападений был построен третий, деревянный замок – на мысу крутого берега Немана. В середине XVII века его усилили бастионными укреплениями.

Стефан Баторий часто бывал в Гродно, прожив в городе последний год своей жизни. В городе в 700 домах проживало около 5000 жителей.

Гродно с окрестным поветом входило в староство – в государственное имение, которое в 1589 году было преобразовано в Гродненскую экономию, доходы которой шли на содержание короля. Все короли, жившие в городе, давали Гродно все новые и новые льготы, что значительно способствовало его развитию.

По приказу короля Сигизмунда III Вазы в Гродно через Неман был построен деревянный мост. В Гродно подолгу жил и Владислав IV.

В энциклопедическом справочнике «Гродно», вышедшем в 1989 году в Минске, написано о войнах XVII–XVIII веков:

«1650—1740-е годы – время экономического упадка в развитии Гродно, что было следствием шляхетской анархии, многочисленных разорительных войн.

В период русско-польской войны 1654–1667 годов город в 1655–1657 году занят русскими войсками, в ходе русско-шведской войны 1656–1658 годов захвачен шведскими войсками, во время Северной войны в 1702–1708 годах несколько раз переходил из рук в руки, был разрушен и разграблен шведскими войсками, а в 1709–1710 годах пережил эпидемию чумы, значительная часть населения погибла. В связи с военными действиями, в районе Гродно в сентябре 1705 года сюда приезжал Петр I, где встречался со своим союзником польским королем Августом II.

Огромный ущерб городу нанесли пожары 1675, 1720, 1750, 1782 годов».