Я рассуждал так: если у нас мало костного материала и если в них ничтожное количество ДНК, то нужно хотя бы снизить потери ДНК на пути от экстракта к библиотеке. И после каникул на пятничном собрании я постарался донести до нашей группы чувство глубочайшего кризиса, в котором мы оказались. Я сказал, что на волшебную кость с кучей ДНК не осталось надежды и ничто чудесным образом нас не спасет. Мы должны использовать только то, что имеем, а это значит — заново переосмыслить каждый шаг лабораторных манипуляций. Например, что мы делаем при очистке ДНК-содержащих растворов? Ведь белков и других веществ в этих растворах совсем чуточка, а цена очистки — потеря большой доли ДНК. Если как-то минимизировать эти потери, то нам, может, и хватит имеющихся костей, и мы тогда дотянем до выпуска новых технологий 454.
Я неделю за неделей переспрашивал своих сотрудников, как именно они выполняют каждый из этапов работы с костями. Этот способ задавать один и тот же вопрос снова и снова я извлек из своего полузабытого юношеского прошлого, когда на военных сборах в Швеции нас учили допрашивать заключенных. И чем больше я спрашивал, тем больше приходил к убеждению, что при тщательной очистке вытяжек, предписанной протоколом 454, мы, по-видимому, теряем непомерно большую часть ДНК. И продолжал настаивать на осмыслении каждого шага этого протокола. А что еще оставалось делать?
В мои студенческие годы в молекулярной биологии вовсю использовались радиоактивные метки. Но потом во избежание обременительных мер предосторожности молекулярные биологи перешли к нерадиоактивным стратегиям. Потому теперешние студенты практически не имеют опыта работы с радиоактивными включениями. Однако при этом радиоактивные метки остаются наиболее чувствительным методом обнаружения даже ничтожного количества ДНК. И вот на одном из наших пятничных собраний я предложил Томи Маричичу пометить небольшое количество ДНК радиоактивным фосфором и использовать раствор для приготовления отсеквенированной библиотеки. А раствор с остатками ДНК, которые в обычных случаях выбрасываются, можно измерить на радиоактивность. Уровень радиоактивности покажет, сколько ДНК из раствора не пошло на секвенирование. Таким образом, можно напрямую измерить уровень потерь при очистке вытяжек.
Мой план, когда я изложил его на пятничном собрании, был встречен молчанием. Я сначала подумал, что все просто замерли в молчаливом восхищении перед изяществом и простотой моего решения. Но на самом деле в своем бездумном натиске я не принял во внимание, как живет моя группа. В подобном устройстве жизни кроется реальная сила исследовательской группы, но временами оно же оборачивается не на пользу делу. У нас принято было обсуждать любую идею, каждый мог свободно высказывать свое мнение, и в результате на собраниях мы приходили к общему решению, что и как нужно сделать. Но, как и в любой демократии, временами берут верх неразумные решения. На том собрании некоторые выказали решительный скептицизм. К их мнению в группе тогда прислушивались. К моему плану предъявили ряд претензий, вызванных, по-моему, подсознательным страхом перед малознакомыми методиками, к тому же старомодными и небезопасными, и вообще жуткими. Я решил не торопить события. Сначала обратиться к другим методам — попробовать оценить, сколько ДНК остается после каждой процедуры приготовления библиотек, и испытать новую технику для ПЦР. Но все это оказалось бесполезным — обычные методы показали слабую чувствительность или не годились по другим причинам.
Месяц за месяцем я продолжал настаивать на радиоактивном эксперименте, мое нетерпение росло, и я уже страстно жалел об ушедших временах автократии, когда слово профессора было законом. Но, стиснув зубы, соглашался, не желая разрушать атмосферу свободного обмена мнениями, которая, на мой взгляд, очень важна для дела.
И вот, когда все остальные способы были испробованы и отброшены, группа скрепя сердце согласилась. Томи неохотно заказал радиоактивный фосфор, пометил некоторое количество обычной человеческой ДНК, которую мы использовали для проверочных опытов, и потом проделал все процедуры по приготовлению вытяжек для секвенирования по 454. Результат получился ошеломительным. Он показал, что на первых трех этапах теряется от 15 до 60 процентов ДНК. Для биохимических процедур такой уровень потерь в принципе ожидаем. Но на последнем этапе, когда с помощью сильных щелочей разделяются комплементарные нити ДНК, потери против изначального количества достигают более 95 процентов. Естественно, для тех, кто работает с современной ДНК, все эти потери не имеют значения — материала у них полным-полно, так что даже 95-процентная потеря незаметна. А вот при работе с древностями она оборачивается полной катастрофой. Но раз проблема выявлена, то и решение нашлось. Чтобы разделить ДНК на одиночные нити, годятся не только щелочи. ДНК можно просто нагреть. Томи испробовал этот метод и обнаружил, что выход полученного для секвенирования раствора в 10–250 раз выше, чем при воздействии щелочами! С такими картами можно продолжать игру.
В большинстве лабораторий растворы после секвенирования выливают. А мы, к счастью, к этому большинству не относились. По моему настоянию мы сохраняли вытяжки от всех экспериментов — вдруг что новое изобретут, и они вновь пригодятся. Наверное, эта моя идея была наименее популярна среди лабораторного народа. В лаборатории стояли унылые ряды холодильников, забитые замороженными остатками экстрактов, и никому в голову не приходило, что они когда-либо будут использованы. Но спасибо нашим обстоятельствам — навязчивая идея профессора была реабилитирована. Теперь Томи оставалось только подогреть образцы растворов прошлых экспериментов с костями из Виндии и получить новые неандертальские ДНК, и относительно много, и без затрат на рутинные процедуры экстрагирования. Он так или иначе усовершенствовал и другие этапы приготовления библиотек. И в результате выработал пошаговую методику от костных вытяжек до растворов для секвенирования, в сотни раз более эффективную, чем прежние[54].
После обсуждения деталей проекта с хорватскими партнерами мы остановились на трех костях из Виндии — Vi-33.16 и двух других, Vi-33.25 и Vi-33.26. Все они, по-видимому, представляли собой осколки длинных костей, раздробленных, чтобы добраться до костного мозга (см. рис. 12.1). Благодаря усилиям Томи у нас появилась надежда получить только из этих костей 3 миллиарда нуклеотидов неандертальского генома. Но нельзя забывать, что в наших библиотеках по-прежнему содержалось не меньше 97 процентов бактериальной
