К тому времени я был отлично знаком с загрязнениями. В течение двенадцати лет я анализировал древнюю ДНК из вымерших млекопитающих — пещерных медведей, мамонтов, гигантских ленивцев. Раз за разом получая унылые результаты (практически во всех костях после ПЦР я обнаруживал человеческую мтДНК), я обдумывал и изобретал способы, как уменьшить загрязнение. Поэтому Матиас выполнял все приготовительные к ПЦР операции (обработка образцов, вытяжки и все такое — вплоть до первого нагревания смеси) в особой комнатке, сверхчистой, отделенной с абсолютной надежностью от остальных лабораторных помещений. А когда древняя ДНК вместе с праймерами и другими необходимыми для ПЦР компонентами наливались в пробирку, пробирка запечатывалась, ее относили в лабораторию и там уже с ней дальше работали. В “чистой комнате” раз в неделю все поверхности мыли хлоркой и каждую ночь включали ультрафиолет, чтобы разрушить всю занесенную с пылью ДНК. Чтобы туда зайти, нужно было в специальном предбаннике облачиться в защитную робу, надеть на лицо маску, на волосы специальную шапочку, на руки перчатки. Это проделывал и Матиас, и любой, кто работал в “чистой комнате”. Все реактивы и инструменты доставлялись прямо в эту комнату, минуя любые другие институтские помещения. Если кто должен был здесь работать, то здесь же и должен был начаться его день. Раз выйдя (за какой угодно надобностью), вернуться уже было нельзя, ведь мы в лаборатории анализировали огромное количество разнообразных ДНК, и их можно ненароком занести в “чистую комнату”. Мягко выражаясь, у меня развилась паранойя на почве загрязнений, и тому, честно, были причины.
И даже со всеми предосторожностями в тех первых экспериментах нашлись следы загрязнений. После ПЦР всю полученную из кости партию ДНК — а это были предположительно однотипные фрагменты из 61 нуклеотида — Матиас клонировал в бактериальных носителях. Это делалось для того, чтобы проверить, действительно ли получился только один тип фрагментов или там их несколько. В бактерию с помощью специального носителя — плазмиды — встраивался один 61–нуклеотидный фрагмент, в другую бактерию следущий, в третью бактерию следующий далее и т. д. Затем бактерии размножались, и вместе с ними клонировались и встроенные фрагменты ДНК. Таким образом, отсеквенировав ДНК бактерий из выросших колоний, можно было увидеть, какие типы ДНК присутствовали в полученной от ПЦР партии фрагментов. В самых первых Матиасовых эспериментах мы получили 17 колоний с идентичными фрагментами, которые при этом отличались от всех двух тысяч с хвостиком доселе известных современных. И вдобавок к ним еще один фрагмент, которому нашлось соответствие среди этих двух тысяч. Так что загрязнение все-таки было, возможно, от музейных работников, а возможно, от других людей, через чьи руки прошел образец за 140 лет изучения.
Поэтому первым делом Матиас повторил ПЦР и клонирование. На этот раз он выявил 10 клонов с одним и тем же фрагментом, тем самым, выстраданным нами, и еще два других, которые, похоже, произошли от современных людей. Потом Матиас взял другой костный кусочек, сделал из него новую вытяжку, снова провел ПЦР и снова клонировал всю партию в бактериях. И получилось 10 колоний с нашим уникальным фрагментом мтДНК и 4 лишних, современных. И вот тут мы с удовлетворением решили: всё, наш результат прошел первую проверку, мы можем повторять все операции и получать каждый раз ту самую необычную последовательность ДНК.
Матиас приступил к “проходке” вдоль ДНК. Для этого он использовал другие праймеры. Такие, которые строили отрезки ДНК, частично перекрывающиеся с нашим первым, но и удлиняющие его по нити мтДНК (см. рис. 1.2). И снова мы увидели, что в некоторых из этих фрагментов отклонения в ДНК ни на какие современные не похожи. За несколько следующих месяцев Матиас получил 13 кусочков ДНК разной длины, повторив все опыты по меньшей мере дважды. По ходу дела мы встретились с естественными трудностями интерпретации — а что делать, если любая молекула ДНК подвержена мутациям. И причины мутаций могли быть самыми разнообразными: и древние химические модификации, и ошибки секвенирования, и редкие, но все же встречающиеся вариации мтДНК в клетках одного индивидуума. Тут помогла тактика, которую я придумал, еще работая с древней ДНК животных (см. снова рис. 1.2). Для каждой позиции мы принимали за норму такой нуклеотид (А, Т, Г или Ц), который встречается в этой позиции чаще всего во всех размноженных (амплифицированных) и прочтенных последовательностях. Также мы ввели требование, чтобы нуклеотид, стоящий в определенной позиции, был найден по крайней мере в двух независимых повторах. Это было нужно, потому что в некоторых случаях, крайне редких, ПЦР может стартовать только с одной нити. И тогда, в результате подобной ошибки в ПЦР или нарушения в самой ДНК, будут амплифицироваться только клоны этой одной нити, но не комплементарной ей, и в итоге все нуклеотиды конкретной позиции будут совершенно одинаковы. Если в двух экспериментах ПЦР давали разные результаты, то мы повторяли эксперимент третий раз и смотрели, какой из вариантов с ним сойдется. Матиас получил в результате 123 последовательности и затем, прикладывая один кусочек к другому, сложил эту мозаику в участок длиной в 379 нуклеотидов. И это был тот самый изменчивый участок мтДНК. С учетом наших критериев правдоподобия нуклеотидных позиций это был тот самый кусочек ДНК, который некогда работал в живом неандертальце
