Как же вырастить в такой среде чистую культуру микроба, т. е. культуру, происходящую из одной единственной клетки интересующего нас вида? Как выделить нужную нам клеточку диаметром в несколько тысячных долей миллиметра из смеси миллиардов особей, населяющих разводку микробов в жидкой среде?
Было предложено разводить такую среду какой-нибудь простерилизованной жидкостью (водой, солевым раствором) до тех пор, пока в одной её капле не будет содержаться только одна клетка микроба. Такой каплей заражали стерильную питательную среду.
Но этот сложный и трудоёмкий метод не давал всё же абсолютной гарантии чистоты культуры: можно ли быть уверенным, что в капельке действительно находится только одна микробная клетка? Удостовериться в этом можно было только при помощи микроскопа. Выделение чистых культур из одной клетки производится под микроскопическим контролем: на поверхность тоненького стерильного стёклышка (так называемого покровного стекла) стерильным чертёжным пёрышком наносят ряд крошечных капелек из разведённой питательной жидкости, содержащей микробов. Покровное стекло с каплями накладывается на предметное стекло с углублением, края обмазываются вазелином, и получается невысыхающая влажная камера. Микробиолог тщательно просматривает под микроскопом содержимое капелек и отмечает те капли, где находится только по одной клетке. Затем микроскоп вместе с препаратом ставится в особый шкаф — термостат — прибор, сохраняющий постоянную температуру, в котором культивируются разводки микробов. При благоприятной температуре микробная клетка начинает делиться, и скоро в капельке разрастается целое скопление микробов — потомков одной клетки. При помощи простерилизованной над пламенем горелки платиновой иголочки или петельки, вставленной в петледержатель, такой капелькой можно заразить колбу или пробирку с питательной средой и получить в нужном количестве чистую культуру из одной клетки. В последние годы сконструированы особые приборы, так называемые микроманипуляторы, которые дают возможность под контролем микроскопа подхватить тончайшей стеклянной петелькой или пипеткой одну микробную клетку и перенести её в свежую питательную среду. Советский ученый проф. Б. В. Перфильев недавно разработал способ изготовления тончайших стеклянных капилляров. Его прибор, так называемый микроселектор, позволяет под контролем глаза выловить и затянуть в капилляр одну клеточку мельчайшей бактерии, затем автоматически стерильно отломить содержащий эту клетку кусочек капилляра и заразить им свежую питательную среду.
Но обычно в своей текущей работе микробиолог применяет более простой способ получения чистых культур — выделение их на плотных питательных средах. Оставьте в комнате на 10–15 минут тоненький ломтик картофеля и потом, предохранив его от высыхания, поместите на сутки в термостат. Вы увидите, что на поверхности ломтя появились мелкие округлые образования грязно-белого, жёлтого и красноватого цвета. Это так называемые колонии микробов, осевших из воздуха на поверхность картофеля и размножившихся там до видимых невооружённым глазом скоплений (колоний). Каждая колония — это миллиардное потомство одной особи, приставшей к влажной поверхности картофеля. Р. Кох первый обратил внимание на то, что таким путём можно легко выделить чистую культуру микроба, и предложил свой метод «пластинчатых разводок», в которых развивались отдельные колонии, происходящие из одиночных клеток. Кроме ломтей картофеля и моркови, Кох предложил применять в качестве плотной питательной среды питательный мясной бульон, к которому прибавлено 10 процентов желатины. Получается плотный студень, на котором прекрасно развиваются отдельные колонии (рис. 21). Но так как желатина разжижается при 22–26° и не может выдержать температуры термостата, при которой обычно выращивают болезнетворных микробов, то она была заменена агар-агаром, который также придает плотность питательной среде, но плавится только при 100°, а застывает при 40–45°.
Кох разливал свои желатиновые питательные среды на стеклянных пластинках, которые покрывал затем стеклянными крышками. Но этот способ оказался непрактичным. Пластинки Коха легко зарастали посторонними микробами, попадавшими из воздуха. В 1885 г. уже упомянутый нами доктор Гейденрейх, которому русская микробиология обязана тщательной разработкой и усовершенствованием методов исследования микробов, предложил вместо коховских пластинок специальные двойные стеклянные чашечки с крышками, хорошо предохранявшие культуры от загрязнения. Позднее такие же чашечки были описаны в германском микробиологическом журнале зарубежным микробиологом Петри и незаслуженно получили в литературе его имя.
Теперь методика выделения чистых культур стала довольно несложным делом (рис. 22). Разливают в чашки Гейденрейха-Петри расплавленную агаровую питательную среду, которая уже через несколько минут превращается в плотную пластинку. Потом размазывают по поверхности пластинки при помощи простерилизованной платиновой петли или стеклянного шпателя материал, содержащий микробные клетки, и ставят чашку в термостат. Через сутки на поверхности агаровой пластинки вырастают отдельные колонии микробов. Из этих-то колоний с помощью стерильной петли и производится отсев чистых культур в колбы или пробирки (рис. 23), содержащие стерильную питательную среду.
После введения методов чистых культур в практику лабораторных исследований микробиология стала развиваться бурным темпом. Кроме питательных сред, приготовленных из мяса, картофеля, хлеба, солода, стали применять свёрнутый яичный белок, кровяную сыворотку, цельную кровь. На этих средах прекрасно росли многие болезнетворные и гнилостные микробы.
Однако вскоре оказалось, что применявшиеся среды пригодны для выращивания далеко не всех микробов. На них хорошо росли только микробы, привыкшие и в природных условиях усваивать сложные органические соединения. Когда учёные попытались исследовать различные биохимические процессы, происходившие в почве, и выделить чистые культуры почвенных микробов, то выяснилось, что на обычных средах вырастают только гнилостные микробы. Ни за что не удавалось выделить в чистой культуре и уже известных в то время микробов, так называемых нитрификаторов, окисляющих конечный продукт гниения белков — аммиак в соли азотной кислоты. А не располагая чистыми культурами микробов, учёные не могли разобраться в физиологии этих организмов. Не удавалось выделить и другую чрезвычайно важную группу почвенных микробов — азотфиксирующих бактерий.
Открытием методов культивирования этих микробов мы обязаны «отцу почвенной микробиологии», знаменитому русскому микробиологу С. Н. Виноградскому. Микробы-нитрификаторы не растут на плотных мясных средах потому, что они не могут использовать сложные органические соединения — решил Виноградский. Чтобы их вырастить, нужно приготовить раствор из простейших минеральных солей, содержащих аммиак в качестве единственного источника азота. В такой жидкости не будут расти обычные гнилостные микробы, неспособные довольствоваться столь простыми соединениями. Опыты блестяще подтвердили предположение Виноградского: процесс нитрификации исправно шёл в этой простейшей питательной среде. Но как выделить чистую культуру этих бактерий, не растущих на плотной питательной среде? И тут Виноградский применил следующий чрезвычайно оригинальный метод: он делал высевы не из выросших колоний, а из пустых мест чашки с плотной питательной средой, на которой была засеяна смесь, содержавшая нитрифицирующие бактерии. Он совершенно правильно предположил, что там оставались
